免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典方法，其原理和步骤如下：
一、免疫共沉淀原理
抗原-抗体特异性结合 利用针对目标蛋白（抗原）的抗体，通过非变性裂解细胞后，抗体与目标蛋白形成稳定的抗原-抗体复合物。
Protein A/G介导纯化
通过向裂解液中加入预偶联Protein A或Protein G的磁珠（beads），抗体-抗原复合物会特异性结合到磁珠的Fc片段上。随后通过离心或磁力分离，将目标复合物从其他蛋白中纯化出来。
解离与检测
加入还原剂（如DTT）破坏抗原-抗体键，收集上清液。目标蛋白可通过Western Blot、质谱（MS）或免疫印迹（IP）进行检测。
二、免疫共沉淀步骤
1. 样品准备
细胞裂解： 使用RIPA缓冲液（含蛋白酶抑制剂和核酸酶抑制剂）裂解细胞，4℃离心10分钟，取上清作为总蛋白样品。 预实验优化
2. 免疫沉淀反应
抗体孵育：将调整后的抗体加入裂解液，4℃孵育2-4小时。可设置阳性（如加入已知标签蛋白）和阴性（如加入无关IgG）对照组。
磁珠结合：加入Protein A/G磁珠，4℃孵育1-2小时，促进结合。
3. 洗涤与纯化
去除非特异性结合：用PBS多次洗涤复合物，去除未结合的抗体和杂质。
洗脱目标蛋白：加入高盐缓冲液（如SDS-PAGE样品缓冲液）洗脱目标蛋白，或使用磁力柱纯化。
4. 结果分析
蛋白质鉴定：通过SDS-PAGE分离复合物中的蛋白质，或使用Western Blot检测目标蛋白表达。
相互作用验证：结合生物信息学分析（如GO富集、KEGG通路分析）验证蛋白功能。
三、注意事项
抗体选择：
需确保抗体特异性强、结合力高，避免交叉反应。
缓冲液优化：
洗涤步骤需控制离子强度和pH，防止蛋白变性或吸附其他蛋白。
实验重复：
设置多组对照，确保结果可靠性。
通过以上步骤，免疫共沉淀可高效地从复杂蛋白网络中解析目标蛋白的相互作用，是细胞生物学研究中不可或缺的技术手段。