原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织样本中定位特定核酸序列。以下是其核心步骤的详细说明：
一、样品制备
固定与包埋 - 细胞或组织样本需用固定液（如FAA）固定，以保持形态和核酸结构。
- 固定后通过脱水、透明、浸蜡等步骤包埋，最终形成石蜡块，用于切片。
切片与展片
- 石蜡块经切片机切片，厚度通常为5-10μm。
- 切片后通过展片技术（如低温粘片）固定于载玻片上。
二、探针制备
设计互补探针
- 根据目标序列设计DNA或RNA探针，长度通常为200-1000bp。
- 探针需标记荧光素（如FITC）、酶（如辣根过氧化物酶）或同位素（如³H）。
探针标记
- 将探针与转录缓冲液、核苷酸等混合，加热至85℃变性后冷却至室温。
- 可加入RNA酶抑制剂防止降解。
三、杂交反应
样本与探针结合
- 将标记探针与固定样本在适宜温度（如37℃）下孵育，通常需30分钟。
- 低温（如4℃）可延长结合稳定性。
封闭非目标区域
- 用缓冲液（如SSC）封闭样本表面，防止探针非特异性结合。
四、信号检测与图像分析
荧光显微镜观察
- 对荧光标记的探针，使用荧光显微镜检测信号分布和强度。
- 可通过多通道成像分析多个探针。
酶联信号检测
- 酶标记探针通过底物显色反应（如辣根过氧化物酶产生紫色产物）可视化。
五、其他注意事项
样本选择： 需根据研究目的选择合适的细胞或组织类型。 探针优化
设备要求：需荧光显微镜或酶联设备支持。
以上步骤为原位杂交的基本流程，具体细节可能因实验需求（如检测基因组、转录组或蛋白质）有所调整。